（AD1023）Ad-mCherry-GFP-LC3 说明书

产品简介

重组腺病毒表达mCherry GFP-LC3B融合蛋白( Recombinant adenoviruses expressingmCherry GFP LC3B fusion protein, Ad mCherry-GFP-LC3B)，可用于感染细胞或组织后进行细胞自噬流(autophagic flux) 的检测。感染后能够在靶细胞中有效表达红色荧光蛋白(mCherry)、绿色荧光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈现红色和绿色荧光。

自噬体与溶酶体融合后,溶酶体内的酸性环境会导致GFP荧光淬灭，而mCherry在酸性环境中也很稳定，仍能发出红色荧光。因此，通常用mCherry GFP-LC3B分析细胞内的自噬流变化情况。Ad mCherry GFP-LC3B腺病毒感染细胞，自噬流畅通情况下，细胞内绿色荧光消失，红色班点仍然存在;自噬流阻断情况下，细胞能同时显示红色和绿色荧光。

腺病毒感染细胞后为瞬时表达,通常不会与基因组DNA重组，不能用于筛选稳定细胞株。本产品感染体内外细胞后，有效表达时间通常不少于7天，不同细胞和组织的有效表达时间有所不同。感染10-14天后蛋白的表达很可能会大大减弱。

使用说明：

1. 感染条件的确定：

不同种类的细胞感染所需的MOI值是不同的，如果是初次使用腺病毒感染需要通过实验确定最佳的感染条件。

a. 细胞培养(以6孔板Hela细胞为例，其它培养板或培养皿参考6孔板进行操作)：感染前一天在6孔板中以5×10^5/孔接种Hela细胞，每孔加入2ml完全培养液(具体的接种数量由细胞大小和细胞生长速度而定)，使第二天病毒感染时细胞密度达到约70%左右。

b. 按照MOI 分别为2、5、10、20、40，计算所需病毒量，计算方法请参考附录。

c. 冰上解冻病毒，混匀后备用。

d. 从细胞培养箱中取出6孔板，在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好.分别加入特定MOI值的病毒液，同时设置未加入病毒的细胞孔作为对照组。对于培养液体积比较小的多孔板，例如96孔板和48孔板，也可以先把病毒用培养液稀释至所需的MOI值后再加入。

e. 感染后约12h，除去含有病毒的培养液，每孔加入2ml新鲜的完全培养液，继续培养24h后观察细胞生长状况及荧光蛋白表达情况，以不显著影响细胞生长、荧光较强且感染效率便于荧光观察的MOI值为最佳条件。

2. 感染细胞、荧光观察

根据步骤1获得的最佳MOI进行感染实验，在荧光显微镜下观察LC3B的荧光变化情况。