使用方法
1、执行常规SDS-PAGE、转膜和Western Blot步骤。注意用HRP标记lgG或用一抗-链亲和素-生物素-HRP夹法。
操作概述
注:优化抗原和抗体的浓度。必须使用建议的抗体稀释度,以保证阳性结果。
1)将一抗浓度稀释到0.1~0.5 mg/ml;
2)将二抗浓度稀释到10~50 ng/ml;
3)将A液和B液两种组份按1:1比例混合,制备发光工作液;
(注:暴露于日光或任何其他强光可能损害工作液,为获得最佳结果,将此工作液保存在琥珀色瓶中,并避免长期暴露于任何强光。短时间暴露于实验室常规照明不会损害该工作液)
4)将印迹膜在该ECL发光工作液中孵育3~5分钟;
5)移去多余试剂,并用清洁的塑料膜盖住该印迹膜;
6)使印迹膜在X光胶片上曝光。
2、Western Blot最后一次洗膜的同时新鲜配制发光工作液:分别取等体积的溶液A和B,放入干净容器中混合。建议立即使用工作液,室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。
3、用镊子取出膜,搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液(0.01~0.1 ml发光工作液/cm2膜)中,与发光工作液充分接触。室温孵育3~5分钟,准备立即压片曝光。孵育时间过长不会增加灵敏度,有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应,使用过少的发光工作液不利反应进行,也会导致膜上条带曝光不均和明显降低灵敏度。为达节约目的可将膜剪小但勿降低发光液用量。
4、用镊子夹起膜,搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。
5、打开X光胶片暗盒,在暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将Western Blot膜贴在保鲜膜上,将保鲜膜折起来完全包裹Western Blot膜,去除气泡和皱褶,可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶
带将覆盖Western Blot膜的保鲜膜固定在暗盒内,蛋白带面向上。
6、暗房内压X光胶片,分别曝光不同的时间如数秒到数分钟。显影冲洗。