(AD1007)Ad-AMPKa-wt 说明书
产品简介
重组腺病毒表达野生型AMPKa( Rcombint adnoviuses exressing wild type AMPKaAd-AMPKa-wt)。
腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase, AMPK)是一种广 泛表达且高度保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。AMPK由-个催化亚基a和两个调节亚基β、Y构成的异源三聚体,Sestin1 与AMPKa的Thr172相互作用直接激活AMPK。AMPK是细胞的能量调节器能感知细胞能量代谢状态的改变。细胞内能量缺失时,激活AMPK,关闭消耗ATP的合成代谢途径,开启产生ATP的分解代谢途径,维持机体能量代谢平衡。AMK活性索乱与糖尿病、肥胖、心血管疾病等代谢性疾病关系密切。
腺病毒感染细胞后为瞬时表达,通常不会与基因组DNA重组,不能用于筛选稳定细胞株。本产品感染体内外细胞后,有效表达时间通常不少于7天,不同细胞和组织的有效表达时间有所不同。感染10-14天后蛋白的表达很可能会大大减弱。
使用说明
1. 感染条件的确定:
不同种类的细胞感染所需的MOI值是不同的,如果是初次使用腺病毒感染需要通过实验确定最佳的感染条件。
a. 细胞培养(以6孔板Hela细胞为例,其它培养板或培养皿参考6孔板进行操作):感染前一天在6孔板中以5×10^5/孔接种Hela细胞,每孔加入2ml完全培养液(具体的接种数量由细胞大小和细胞生长速度而定),使第二天病毒感染时细胞密度达到约70%左右。
b. 按照MOI 分别为2、5、10、20、40,计算所需病毒量,计算方法请参考附录。
c. 冰上解冻病毒,混匀后备用。
d. 从细胞培养箱中取出6孔板,在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好.分别加入特定MOI值的病毒液,同时设置未加入病毒的细胞孔作为对照组。对于培养液体积比较小的多孔板,例如96孔板和48孔板,也可以先把病毒用培养液稀释至所需的MOI值后再加入。
e. 感染后约12h,除去含有病毒的培养液,每孔加入2ml新鲜的完全培养液,继续培养24h后,收集细胞做western,或提取mRNA做qPCR。以不显著影响细胞生长、并由较强蛋白表达的MOI值为最佳条件。
2. 感染细胞
根据步骤1. 获得的最佳MOI进行感染实验。