(AD1018)Ad-PP2A-wt 说明书
产品简介
重组腺病毒表达带有 FLAG标签的野生型PP2A (Recombinant adenovinuses expresingFLAG tagged wild-type rat PP2ACa, Ad-PP2A wtAd-PP2A)。
PP2A是一种丝苏氨酸蛋白磷酸酶,通过可逆性磷酸化使已磷酸化激活的蛋白质脱磷酸,在信号传导中承担负性调节的作用。PP2A是一种多 功能性酶,底物为众多体内的转录因子和蛋白激酶。存在于哺乳动物中的PP2A是一一个异源三聚化合物,由结构亚基A和催化亚基C (PP2Ac)组成PP2A核心酶(PP2A core enzyme, PP2AD) ,再由调节亚基B与核心酶结合构成PP2A。
腺病毒感染细胞后为瞬时表达,通常不会与基因组DNA重组,不能用于筛选稳定细胞株。本产品感染体内外细胞后,有效表达时间通常不少于7天,不同细胞和组织的有效表达时间有所不同。感染10-14天后蛋白的表达很可能会大大减弱。
使用说明
1. 感染条件的确定:
不同种类的细胞感染所需的MOI值是不同的,如果是初次使用腺病毒感染需要通过实验确定最佳的感染条件。
a. 细胞培养(以6孔板Hela细胞为例,其它培养板或培养皿参考6孔板进行操作):感染前一天在6孔板中以5×10^5/孔接种Hela细胞,每孔加入2ml完全培养液(具体的接种数量由细胞大小和细胞生长速度而定),使第二天病毒感染时细胞密度达到约70%左右。
b. 按照MOI 分别为2、5、10、20、40,计算所需病毒量,计算方法请参考附录。
c. 冰上解冻病毒,混匀后备用。
d. 从细胞培养箱中取出6孔板,在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好.分别加入特定MOI值的病毒液,同时设置未加入病毒的细胞孔作为对照组。对于培养液体积比较小的多孔板,例如96孔板和48孔板,也可以先把病毒用培养液稀释至所需的MOI值后再加入。
e. 感染后约12h,除去含有病毒的培养液,每孔加入2ml新鲜的完全培养液,继续培养24h后,收集细胞做western,或提取mRNA做qPCR。以不显著影响细胞生长、并由较强蛋白表达的MOI值为最佳条件。
2. 感染细胞
根据步骤1. 获得的最佳MOI进行感染实验。