（AD1003）Ad-dn-AKT 说明书

产品简介

重组腺病毒表达带有HA标签的钝化Akt (Recombinant adenovinscs expressinghemagglutinin (HA)-agged dominant-negative (dn)Akt, Ad-dn-Akt)。

Akt是一种丝/苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase, Akt) 也被称为蛋白激酶B(protcin kinase B, PKB),分子量约为57kD,是PI3K-Akt信号通路的重要组分部分: PI3K将活化产生的3.4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)与Akt中的PH结构域结合后相互作用，使得Akt的构象变化，导致Akt的两个重要磷酸化位点暴露(Thr308位f激酶活性区，Ser473位于羧基末端的调节区).Thr308磷酸化对于Akt的活化是必需的，但同时位于羧基端Ser473残基磷酸化对于Akt的完全活化也是必需的。活化后的Akt发生转位，进入细胞质和细胞核，而这些区域则含有Akt的作用底物，如Bad、Caspase9、NF-xB、 Forkhcad、 mTOR、Par-4、p21等，从而介导细胞生长，经多种途径促进细胞存活。Akt是重要的抗细胞凋亡调节因子。Akt处于多条信号通路的重要交叉点，通过影响下游多种因子的活化状态，发挥着抑制调亡、促进增殖的关键作用。

腺病毒感染细胞后为瞬时表达，通常不会与基因组DNA重组，不能用于筛选稳定细胞株。本产品感染体内外细胞后，有效表达时间通常不少于7天，不同细胞和组织的有效表达时间有所不同。感染10-14天后蛋白的表达很可能会大大减弱。

使用说明

1. 感染条件的确定：

不同种类的细胞感染所需的MOI值是不同的，如果是初次使用腺病毒感染需要通过实验确定最佳的感染条件。

a. 细胞培养(以6孔板Hela细胞为例，其它培养板或培养皿参考6孔板进行操作)：感染前一天在6孔板中以5×10^5/孔接种Hela细胞，每孔加入2ml完全培养液(具体的接种数量由细胞大小和细胞生长速度而定)，使第二天病毒感染时细胞密度达到约70%左右。

b. 按照MOI 分别为2、5、10、20、40，计算所需病毒量，计算方法请参考附录。

c. 冰上解冻病毒，混匀后备用。

d. 从细胞培养箱中取出6孔板，在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好.分别加入特定MOI值的病毒液，同时设置未加入病毒的细胞孔作为对照组。对于培养液体积比较小的多孔板，例如96孔板和48孔板，也可以先把病毒用培养液稀释至所需的MOI值后再加入。

e. 感染后约12h，除去含有病毒的培养液，每孔加入2ml新鲜的完全培养液，继续培养24h后，收集细胞做western，或提取mRNA做qPCR。以不显著影响细胞生长、并由较强蛋白表达的MOI值为最佳条件。

2. 感染细胞

根据步骤1. 获得的最佳MOI进行感染实验。