使用说明

1、装载探针

对于刺激时间较短（2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照试剂或自己感兴趣的药物刺激细胞；对于刺激时间较长（6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μM的工作液。去除细胞培养液，加入适当体积DCFH-DA工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于6孔板的每个孔加入DCFH-DA工作液不少于1 mL。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照试剂在刺激细胞20～30分钟后即可显著引起活性氧水平升高。

收集细胞后装载探针：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μM的工作液。细胞收集后悬浮于DCFH-DA工作液中，细胞浓度为1×106～2×107/mL，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3～5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照试剂或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照试剂在刺激细胞20～30分钟后即可显著引起活性氧水平升高。

说明：只在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不要加入Rosup。

2、检测

对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

3、检测参数

使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，实时或在设定的时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考图1。

注意事项

1、DCFH-DA探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱请参考图1。

3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5、定量的话要作标准曲线吧。先做一个不同浓度H2O2氧化DCFA荧光值，做一条标准曲线，X轴为H2O2浓度，Y轴是荧光值，得出一个方程，在看你样品的荧光值即Y值是多少，对应的X值就是。

6、有的细胞装载探针后细胞容易漂起来，洗细胞时实验组会吸走一部分细胞。所以种细胞时细胞量增加一倍，这样细胞紧密连接，贴壁比较牢，实验组的荧光值就高了。另外的DCFH-DA很敏感，工作液浓度要低一些，1-2 μM就够啦，浓度太高容易有非特异性染色。这个探针很不稳定，一旦氧化了本底荧光值就会升高，建议工作液现配现用。